M13噬菌体单链DNA提取试剂盒

产品货号：

ALH161

中文名称：

M13噬菌体单链DNA提取试剂盒

英文名称：

M13 phage single strand genomic DNA rapid extraction kit

产品规格：

50次|100次|200次

发货周期：

1～3天

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M13和其它的丝状噬菌体载体，在文库构建和为序列测序提供单链DNA和引人突变方面十分有用。将适量M13丝状噬菌体或者相关噬粒（M13来源）感染的液体培养物离心，上清中的单链噬菌体DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，将盐、细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净噬菌体单链DNA从硅基质膜上洗脱。

不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
节省时间，简捷，单个样品操作一般可在10分钟内完成。
产量高，典型的产量800μL M13丝状噬菌体上清可以提取3μg噬菌体单链DNA。
多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9。可以直接用来测序，一般典型可辨认读长达650bp。

组分	50T	100T	200T
结合液MB	25mL	50mL	100mL
漂洗液WB	13mL	25mL	50mL
漂洗液WB	第一次使用前按说明加指定量乙醇
洗脱缓冲液EB	10mL	20mL	40mL
吸附柱AC及收集管（2mL）	50套	100套	200套

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
结合液MB低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
开始实验前将需要的水浴先预热到50℃备用。
结合液MB含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

以800μL噬菌体感染细菌培养上清提取举例，第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入！

将M13丝状噬菌体或者相关噬粒（M13来源）感染的液体培养物分装在1.5毫升离心管，12000rpm离心5分钟沉淀菌体。
小心取800μL上清转入新的1.5mL离心管，加入400μL结合液MB，充分混匀。
注：如果使用的上清大于或者小于800μL，则结合液MB的用量需要按照比例增加或者减少。
将上述混合物加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液。
注：吸附柱一次最多只可以容纳大约700μL混合物，因此需要分次把混合物加到吸附柱内，重复步骤3。
加入600μL漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30秒，弃废液。
将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加60μL洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在50℃水浴中预热），室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。如果想得到较多量的DNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，10000rpm离心1分钟。
注：洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于40μL，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。
DNA可以存放在2～8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。

低核酸产量或者纯度不高
- 试剂盒储存在非最佳条件
  建议：收到试剂盒后总是存放在室温（15～20℃）。
- 缓冲液或者试剂暴露于减少它们有效性的条件下
  建议：储存在室温（15～20℃），每次用完后立刻盖紧盖子，以免溶液蒸发，pH改变和污染。
- 漂洗液WB中忘记加无水乙醇
  建议：第一次实验时，在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇。
- 试剂和样品没有充分混匀
  建议：加入每个试剂后都要充分混匀。
- 噬菌体上清滴度太低
  建议：离心取噬菌体感染细菌培养物上清时离心最好不要超过5分钟，转速不要超过12000rpm，否则噬菌体上清也可能离心下来。重新培养一次噬菌体感染细菌。
- 洗脱效率不高
  建议：确保做了步骤5，否则残留乙醇会影响洗脱效率，仔细阅读步骤6和只使用洗脱缓冲液EB洗脱。
DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全
- 忘记做步骤5，乙醇抑制了酶切反应
  建议：做步骤5，然后空气中晾几分钟，让残留乙醇挥发。
- 一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑制了酶切反应
  建议：将洗脱的基因组DNA溶液13000rpm再离心一分钟，小心取上清使用。
纯化的DNA产物D260数值异常偏高
- 一些硅基质膜成分一起洗脱下来，干扰了分光光度计读数
  建议：将洗脱的回收DNA溶液13000rpm再离心一分钟，小心取上清使用。

附录：M13噬菌体感染细菌培养上清准备过程
下面举例说明M13噬菌体感染细菌培养上清准备过程，详细的M13噬菌体（或M13来源噬粒）培养和上清准备过程请参见『分子克隆』第二版。

37℃振摇过夜培养合适的噬菌体宿主菌（如JM109）。
使用6％的过夜培养菌接种新鲜的LB培养液，37℃振摇培养一个小时。
根据M13噬菌体的储存液的浓度（滴度）按照0.5～1.5%(V/V)的比例加入噬菌体来感染宿主菌。37℃振摇培养5～6个小时。
将上面M13丝状噬菌体或者相关噬粒（M13来源）感染的液体培养物分装在1.5毫升离心管，12000rpm离心5分钟沉淀菌体。
可选步骤:小心取1毫升上清转入新的1.5mL离心管，重复步骤4离心5分钟。
这步有助于去除上清中残留的微量宿主菌RNA或者DNA。
小心取800μL上清转入新的1.5mL离心管。
现在可以按照操作步骤提取噬菌体单链DNA了。

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